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神经干细胞移植治疗缺血性脑卒中(脑中风)的研究
查看所有内容  时间:2010-8-4 11:19:32  来源:本站  点击:1546

  缺血性神经细胞损伤有神经元坏死和凋亡两种方式。神经元一旦死亡就不可再生,这是脑缺血患者致残的根本原因。在胚胎、成年动物甚至人脑中可分离出一种未分化的原始细胞,因其具有自我更新能力和多潜能分化能力,称之为神经干细胞[1],其为修复缺血性脑卒中后遗症提供了理论基础。2005~2006年,我们研究了神经干细胞移植对缺血性脑卒中大鼠模型(tMCAO)后遗症的修复作用,并确定移植的最佳时机。
  1 材料与方法
  1.1 实验动物 实验动物(Wistar大鼠)由山东大学动物实验中.心提供。取Wistar雄性大鼠(体质量28O~32'0 g)制备tMCA0。干细胞培养取自Wista孕鼠(孕14 d)胎鼠脑。
  1.2 主要实验器材 试剂超净工作台、COz恒温培养箱、荧光显微镜、KOPF鼠立体定向仪、全自动微量注射器(UMP22型)和冰冻切片机等。DMEM/F12,B27,碱性成纤维生长因子(bFGF),表皮生长因子(EGF),抗巢蛋白(nestin)单抗,抗5一溴脱氧尿核苷(BrdU)单抗。BrdU一抗为鼠抗BrdU 抗体,二抗为羊抗鼠IgG—CY3,抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多抗,抗微管蛋白一2(MAP一2)单抗。
  1.3 神经干细胞的制备取孕14 d Wistar大鼠的胚胎,分离出海马组织,机械消化至呈单细胞悬液,按Vescoi方法制备[2]。经机械消化后连续传代(6次)。
  1.4 tMCAO的建立与分组 按Hayashi等的方法建立tMCAO。右大脑中动脉阻断时间为2 h。tMCAO建立后3d,对所有动物进行神经损害程度评分(NSS):10~14分为重度损伤,5~9分中度损伤,1~4分为轻度损伤。评分后分成移植对照组(A组,移植与神经干细胞悬液同等量的PBS)、超早期治疗组(B组,术后1 d移植神经干细胞)、早期治疗组(C组,术后3 d移植神经干细胞)和晚期治疗组(D组,术后7 d移植神经干细胞)。每组10只。
  1.5 神经干细胞移植分别在tMCAO制备后的第2、4、8天进行神经干细胞移植。移植前神经干细胞经BrdU(10 t~mol/I )标记,再将其溶解于PBS中,干细胞计数后将其浓度调整至2 x 1O 7/1OO ul,移植量为10u1。将大鼠麻醉、固定于立体定向仪,经微量注射泵进行脑内注射移植。移植速度为2ul/min。移植部位为右侧纹状体缺血半暗区,即参照鼠脑立体定向图谱:前囟后0.5 mm、前囟右侧3.5 mm,进针深度0.5 mm。注射完毕后留针10 rain,以防止液体反流。
  1.6 神经功能改善评价与统计学方法 分别于移植后0.5、1、2、4、6、7、8周对雄性大鼠进行NSS评分。应用Windows SPSS 1 1.5软件对数据进行方差分析。P≤ 0.05为差异有统计学意义。
  1.7 组织免疫荧光鉴定 于第8周NSS评分后麻醉,经4 多聚甲醛灌注并固定取脑。于移植点附近做层厚10 bLm 的冰冻切片,根据试剂盒说明书进行操作。用Leica激光共聚焦扫描显微镜观察免疫荧光双标结果。应用BrdU单抗免疫组化法检测培养细胞的增殖情况。GFAP染色阳性的星形细胞是由外源性神经干细胞分化而成。
  2 结果
  2.1 神经干细胞及其分化能力的鉴定 本实验在神经干细胞分化前后进行nestin抗原抗体实验,以证明分离的细胞群是神经干细胞。大鼠神经干细胞体外培养显示其良好的自我繁殖能力和多向分化能力。体外诱导分化可分化为神经干细胞。分化的神经干细胞呈网状相互交错。
  2.2 各组tMCAO的评价动物出现前肢屈曲、向手术对侧推动时倾倒、提尾旋转、行动不协调、偏瘫、不能站立和行走、痉挛、昏迷等表现则表示模型制作成功。本实验建立的tMCAO均符合上述要求,NSS评分为(6.8±1.7)分。
  2.3 治疗后各组NSS评分与免疫学评价NSS评分见表1。大鼠脑切片免疫组化染色可见大量BrdU染色阳性的细胞散布在脑内,证明是移植的外源性神经干细胞的细胞株。该细胞群中还可见大量GFAP染色阳性的星形细胞,这是由外源性神经干细胞分化而成。
 

  3 讨论
  3.1 细胞移植治疗脑卒中的机制和途径无论是将细胞移植到脑卒中损伤同侧还是对侧半球,细胞都并不是仅仅存在于注射位点或注射侧半球,而是分布于病灶侧和健侧半球。这说明细胞不止接受脑卒中直接损伤所产生的信号的指引,还接受健侧半球神经支配和重组。因此,其神经修复的机制可能包括:① 移植的细胞迁移到损伤侧,重建局部环路,这些环路足够保持某些功能;② 移植细胞扩大健侧半球的自发重组,行使或弥补损伤侧半球丧失的某些功能。在早期阶段,神经功能改善可能主要是由于移植的细胞产生的营养因子在发挥作用;而在晚期阶段,神经功能改善可能主要是由于移植的细胞替代变性的宿主细胞发挥作用。骨髓基质细胞可能主要是由于其分泌的神经营养因子和细胞外基质的作用;而神经干细胞可能是以替代损伤神经元、重建环路为主。

  3.2 神经干细胞移植时间 急性脑梗死,由于存在严重的动脉阻塞,缺少血液供应,会影响移植物的存活。L i等研究发现局灶性脑梗死后,缺血半暗区的细胞凋亡持续存在4周。这说明缺血性损伤是一个进展的过程。在这期间,将细胞移植到病灶周围,兴奋性毒性神经递质、自由基、前炎症介质可能威胁移植的细胞。因此,移植时间的选择必须考虑脑卒中恢复的自然过程,许多研究者延迟移植时间一直到功能缺损达到平台期。然而,过分延长移植的等待时间,会导致瘢痕组织的形成,而这又不利于移植。Eriksson等 ]认为脑损伤当时的微环境不利于移植细胞的存活,可能是低氧等不利因素所致。同时,这种微环境随着时间的延长而逐渐改善。也有人认为缺氧、缺血损伤期间或损伤后尽早进行干细胞移植有效,而对缺血性脑卒中后神经干细胞移植的研究却发现移植与损伤间隔7 d左右时移植细胞存活率最高,可能与此时的神经毒性物质减少,神经营养因子释放和血管发生有关[6]。我们认为,卒中3 d后移植较合适。本C组NSS评分最低。

  影响神经干细胞移植疗效的具体机制目前尚未明确,考虑可能与多因素(除移植时间外还可能与移植位点 、移植细胞量 。 等)有关。在本实验中,我们在不同时间采用立体定向移植到大鼠的脑缺血区域,并且移植后对大鼠的功能恢复进行评价,免疫组织化学方法染色检查存活的细胞。显示了神经干细胞具有减轻缺血后神经功能损害的作用,并且我们认为在早期移植具有最佳的效果。首先,B、C、D组NSS评分明显低于A 组,说明神经干细胞在宿主脑内迁移和分化;其次,C组的NSS评分低于B、D组,说明脑损伤后早期的微环境较利于移植细胞的存活。

 
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